知識分享 | 熒光和熒光顯微鏡基礎(chǔ)知識

盡管熒光顯微鏡滲透到細(xì)胞和分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，但大多數(shù)生物學(xué)研究者對潛在的光物理現(xiàn)象卻知之甚少。了解熒光顯微鏡的基本原理有助于解決成像問題。此外，熒光顯微鏡正處于快速發(fā)展的狀態(tài)，幾乎每天都會出現(xiàn)新技術(shù)、探針和設(shè)備。熟悉熒光是利用這些發(fā)展成果的先決條件。本文試圖提供一個(gè)框架來理解熒光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射、熒光顯微鏡的工作方式以及一些可以優(yōu)化熒光的方法。
多年來，顯微鏡的許多技術(shù)改進(jìn)都集中在增加感興趣（信號）和非感興趣（背景）之間的對比度。熒光顯微鏡就是一個(gè)典型的例子，因?yàn)樗荚谠诤谏尘爸袃H顯示感興趣的物體。由于其固有的選擇性，熒光成像已成為顯微鏡在生物學(xué)研究中的支柱。在過去的幾十年里，有機(jī)化學(xué)家設(shè)計(jì)了數(shù)千種熒光探針，幾乎可以標(biāo)記生物系統(tǒng)的任何方面?？捎脽晒鈭F(tuán)的光譜范圍很廣，可以同時(shí)對不同的細(xì)胞、亞細(xì)胞或分子成分進(jìn)行成像。
此外，利用固有熒光基因產(chǎn)物（最顯著的是綠色熒光蛋白 (GFP) 及其變體）使分子生物學(xué)家能夠?qū)ι锵到y(tǒng)的蛋白質(zhì)成分進(jìn)行遺傳標(biāo)記，并開創(chuàng)熒光的新時(shí)代。最后，激光掃描共聚焦和雙光子顯微鏡的快速發(fā)展意味著熒光方法現(xiàn)在提供了一種強(qiáng)大的方法，可以觀察三維微觀結(jié)構(gòu)，甚至組織深處的結(jié)構(gòu)。出于這些原因，如果不了解熒光的基礎(chǔ)知識，就很難進(jìn)行細(xì)胞或分子生物學(xué)研究，而且這種趨勢正在加速。

01
熒光原理  ?    

1. 激發(fā)和發(fā)射

熒光顯微鏡要求目標(biāo)物體發(fā)出熒光。熒光是在吸收通常波長較短的光后幾納秒內(nèi)發(fā)生的光發(fā)射。激發(fā)波長和發(fā)射波長之間的差異稱為斯托克斯位移，這是熒光如此強(qiáng)大的關(guān)鍵特性。通過完全過濾激發(fā)光而不阻擋發(fā)射的熒光，可以只看到發(fā)出熒光的物體。這種對比方法優(yōu)于吸收技術(shù)，在吸收技術(shù)中，物體被用吸光劑染色。使用吸光染料，對于小物體，吸收的光量與背景只有微乎其微的差別。然而，在熒光中，如果背景沒有自發(fā)熒光，即使是單個(gè)熒光分子也是可見的。
2. 熒光團(tuán)
利用其熒光特性使用的分子稱為熒光團(tuán)。熒光團(tuán)分子中最外層電子軌道決定了其作為熒光化合物的效率以及吸收和發(fā)射的波長。當(dāng)熒光化合物在其所謂的“基態(tài)”吸收光能（光子）時(shí)，分子的電子、振動和旋轉(zhuǎn)狀態(tài)就會發(fā)生變化。吸收的能量有時(shí)會將電子移動到平均距離原子核更遠(yuǎn)的不同軌道。這種向“激發(fā)態(tài)”的轉(zhuǎn)變發(fā)生得非?？欤ㄒ燥w秒為單位）。通常，激發(fā)過程也會引發(fā)分子振動，其中核間距離隨時(shí)間變化。所有這些吸收的能量最終都會消失。振動弛豫和熒光發(fā)射是熒光團(tuán)返回其低能基態(tài)的主要方式。雖然許多有機(jī)物質(zhì)具有固有熒光（自發(fā)熒光），并且少數(shù)可用于生物系統(tǒng)中成分的特定標(biāo)記，但熒光顯微鏡的典型方法是利用具有一定程度的共軛雙鍵的合成化合物。此類化合物通常具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)（芳香分子），其中的π鍵可輕松將外軌道電子分布在廣闊的區(qū)域。這些化合物最適合熒光顯微鏡，因?yàn)榧ぐl(fā)態(tài)和基態(tài)軌道之間的能量差異足夠小，以至于電磁波譜可見部分中相對低能的光子可用于將電子激發(fā)到激發(fā)態(tài)。通常，分子中的共軛鍵越多，激發(fā)能量要求越低，激發(fā)光的波長越長（越紅）。發(fā)射光沿同一方向移動。此外，以熒光量子產(chǎn)率衡量的效率隨著π鍵數(shù)量的增加而增加。在 GFP 中，位于桶狀蛋白質(zhì)中心的 α 螺旋中的三種氨基酸（Ser-Tyr-Gly）的翻譯后改變形成具有共軛雙鍵和平面結(jié)構(gòu)的咪唑烷酮環(huán)。該環(huán)結(jié)構(gòu)是發(fā)色團(tuán)。環(huán)結(jié)構(gòu)中的突變會增加更多的共軛鍵，從而將熒光激發(fā)和發(fā)射移至更長的波長，就像黃色熒光蛋白 (YFP) 一樣。
3. 電子躍遷
了解激發(fā)和發(fā)射過程細(xì)節(jié)的一種有用方法是將該過程呈現(xiàn)為 Alexander Jablonski 在 20 世紀(jì) 30 年代首次構(gòu)想的圖表形式。圖表左側(cè)是單線態(tài)。這些狀態(tài)保持電子的成對 + ? 和 ? ? 自旋狀態(tài)與正常情況相同，成對電子中的每個(gè)電子具有相反的自旋。S0 是基態(tài)，表示未被光激發(fā)的分子的能量。S1 和 S2 是激發(fā)單重態(tài)，其中外層電子被提升到不同的軌道。S2 包含的能量比 S1 多，而 S1 包含的能量比基態(tài) S0 多。圖右側(cè)是三重態(tài)，其中外層電子被提升到新軌道，隨后也經(jīng)歷了自旋反轉(zhuǎn)，因此之前的一對電子現(xiàn)在平行。根據(jù)量子理論，電子不能處于除成對電子中存在的兩個(gè)自旋狀態(tài)（+? 或 –?）之外的任何自旋狀態(tài)；因此，電子要反轉(zhuǎn)自旋，必須經(jīng)歷“禁忌”躍遷，這相對不太可能。盡管如此，電子仍可以在單線態(tài)和三線態(tài)之間發(fā)生“系間竄越”。

4. 激發(fā)光譜
當(dāng)熒光團(tuán)吸收光時(shí)，光子所擁有的所有能量都會轉(zhuǎn)移到熒光團(tuán)。該能量與光子的波長成反比（E = h × c / λ，其中 h 是普朗克常數(shù)，c 和 λ 分別是真空中光的速度和波長）。如果吸收的光子能量大于從基態(tài)精確躍遷到 S1 最低能級所需的能量，分子也會發(fā)生振動、旋轉(zhuǎn)和/或移動到更高的電子軌道 (S2) 的變化。因此，有一系列波長可以激發(fā)分子。然而，熒光所需的最小能量來自能夠?qū)е码娮榆S遷到更高電子激發(fā)態(tài)（即 S0 到 S1）的光子。分子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)所需的時(shí)間非常短，約為飛秒（大致等于以光速傳播的特定波長的光子與分子相遇所需的時(shí)間）。雖然一個(gè)具有適當(dāng)能量的光子通常會導(dǎo)致這種轉(zhuǎn)變，但多個(gè)光子也可以增加其能量，使分子進(jìn)入激發(fā)態(tài)。例如，如果兩個(gè)能量為達(dá)到激發(fā)態(tài)所需能量一半（即波長兩倍）的光子同時(shí)撞擊分子，它們的能量可以相加并提供雙光子激發(fā)。
熒光團(tuán)的激發(fā)光譜可以通過測量熒光產(chǎn)量來經(jīng)驗(yàn)性地確定，方法是將各種波長的光照射到含有熒光團(tuán)的比色皿上，并記錄在熒光光譜的峰值波長處產(chǎn)生的熒光斯托克斯位移光量。激發(fā)光譜中的峰和谷反映了分子 Jablonski圖中的能級。例如，對于許多分子來說，在 S1 的最高能級和 S2 的最低能級之間只有少數(shù)振動或旋轉(zhuǎn)狀態(tài)，因此對于許多熒光團(tuán)來說，吸收光譜在與激發(fā)到 S1 能級相關(guān)的較長波長峰值和與 S2 能級相關(guān)的較短波長吸收之間顯示出下降趨勢。毫不奇怪，考慮到獲得激發(fā)所需的閾值能量，激發(fā)能量在光譜的低能量-長波長側(cè)具有比短波長-高能量側(cè)更尖銳的截止，而短波長-高能量側(cè)沒有尖銳的截止；盡管實(shí)際上，玻璃對紫外線的光學(xué)不透明度限制了熒光顯微鏡在近紫外線以外的激發(fā)。熒光團(tuán)吸收光子的概率稱為其摩爾消光系數(shù)ε，單位為M-1cm-1。該屬性測量光穿過含有熒光團(tuán)的溶液時(shí)被吸收的概率，類似于（盡管單位不同）染料的“橫截面”，這意味著分子可以被想象為目標(biāo)，橫截面越大，它捕獲光子的可能性就越大。ε的值是針對吸收最大的波長指定的，即其橫截面最大的地方。有用的小有機(jī)熒光團(tuán)的 ε 值介于 ~25,000 和 ~200,000 之間（值越高，吸收效果越好）。所謂的“增強(qiáng)型”GFP (EGFP) 的激發(fā)最大值移至 488 nm，ε 約為 60,000，比激發(fā)最大值為 470 nm 的野生型 GFP 高五倍。當(dāng)需要將光強(qiáng)度保持在最低水平時(shí)，例如對活體組織進(jìn)行成像或熒光團(tuán)分子很少時(shí)，消光系數(shù)高的染料往往很有用。在其他條件相同的情況下，對于相同量的光誘導(dǎo)背景，消光系數(shù)較高的染料也會比消光系數(shù)較低的染料產(chǎn)生更大的信號。
5. 發(fā)射光譜
一旦被激發(fā)，分子就會使用幾種不同的途徑最終失去吸收的能量并返回基態(tài)?！皟?nèi)部轉(zhuǎn)換”是電子軌道狀態(tài)（例如 S2 到 S1）之間的轉(zhuǎn)換。嚴(yán)格地說，內(nèi)部轉(zhuǎn)換允許從一個(gè)電子狀態(tài)的低振動能量到較低電子狀態(tài)的高振動模式的等能轉(zhuǎn)換，因此在此轉(zhuǎn)換過程中不會損失任何能量，但多余的能量最終會通過振動弛豫而釋放。在振動弛豫過程中，熒光團(tuán)中的振動能量通過直接相互作用轉(zhuǎn)移到附近的分子。在水性介質(zhì)中，水可能是能量接收者。值得注意的是，振動弛豫不會導(dǎo)致任何發(fā)射的光子。內(nèi)部轉(zhuǎn)換和振動弛豫需要皮秒的時(shí)間，通常會將分子帶回到S1的最低能級。內(nèi)部轉(zhuǎn)換有時(shí)會將激發(fā)的分子完全轉(zhuǎn)換為基態(tài)S0，但對于大多數(shù)熒光團(tuán)而言，基態(tài)振動模式和第一個(gè)單重激發(fā)態(tài)之間的能量差異足夠大，因此這種路徑不是首選。激發(fā)的分子現(xiàn)在具有與基態(tài)類似的振動狀態(tài)，但外層電子軌道仍包含額外的能量。

在良好的熒光團(tuán)中，返回基態(tài)的首選最終能量路徑是排出一個(gè)光子，該光子的能量覆蓋了 S1 的最低振動狀態(tài)和 S0 的任何一個(gè)振動或旋轉(zhuǎn)狀態(tài)之間的間隙。熒光團(tuán)的發(fā)射光譜只是該發(fā)射光子可以具有的波長范圍。該光譜可以通過激發(fā)熒光團(tuán)（通常在其峰值吸光度波長處）并使用設(shè)備測量熒光光譜來經(jīng)驗(yàn)性地確定。考慮到非輻射下降到 S1 的最低水平，發(fā)射光的波長與激發(fā)光的特定波長無關(guān)；因此，不能通過改變激發(fā)光的顏色來改變發(fā)射光譜。在大多數(shù)情況下，發(fā)出的發(fā)射光也與激發(fā)光子的入射方向無關(guān)，因此光子可以以與入射光子相反的方向發(fā)射，如下面描述的標(biāo)準(zhǔn)落射熒光顯微鏡中的情況一樣。由于發(fā)射從 S1 的最低能級開始，因此發(fā)射光子的能量通常小于吸收光子，因?yàn)檎駝映谠ズ蛢?nèi)部轉(zhuǎn)換會去除多余的能量——這是斯托克斯位移的起源。斯托克斯位移的幅度因熒光團(tuán)而異。通常，大的位移具有更容易分離激發(fā)光和發(fā)射光的優(yōu)勢。但并非所有熒光發(fā)射都發(fā)生在比激發(fā)光更長的波長上。通常少數(shù)基態(tài)熒光團(tuán)在被激發(fā)時(shí)處于 S0 的較高振動狀態(tài)之一。在這些情況下，光子可以以比達(dá)到 S1 所需的更大的能量躍遷回落，這解釋了發(fā)射和激發(fā)光譜的重疊。更嚴(yán)重的重疊問題涉及在同一樣本中對多個(gè)熒光團(tuán)進(jìn)行成像。鑒于每個(gè)熒光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射光譜較寬，即使是光譜偏移的熒光團(tuán)也可以被相同波長激發(fā)并表現(xiàn)出重疊的發(fā)射。

這些重疊可能導(dǎo)致同一樣本中不同熒光團(tuán)相關(guān)信號之間產(chǎn)生令人困惑的串?dāng)_或滲透。通過有機(jī)合成更寬光譜范圍的熒光團(tuán)（通過添加更多共軛鍵），這一困難得到了改善，現(xiàn)在允許用戶選擇激發(fā)和/或發(fā)射光譜重疊較小的熒光團(tuán)。然而，串?dāng)_仍然是熒光蛋白的一個(gè)嚴(yán)重問題，因?yàn)闊晒獾鞍紫鄬τ谛〉挠袡C(jī)化學(xué)熒光團(tuán)具有非常寬的激發(fā)和發(fā)射光譜。在這里，新的波長偏移變體也可能起到拯救作用。雖然轉(zhuǎn)移到更長的波長，但發(fā)射熒光的光譜與吸收光光譜的主要部分具有鏡像對稱性。這種對稱性與從 S1 的最低振動狀態(tài)最終回到基態(tài)有關(guān)。回到基態(tài)的振動躍遷與吸收期間發(fā)生的振動躍遷相同。在每種情況下，分子通常從“0”振動狀態(tài)開始，然后移動到相同或更高的振動狀態(tài)，例如 0、1、2 或 3。這些振動躍遷在任一方向上具有相同的可能性。例如，S0 能級 0 到 S1 能級 3 的可能性與 S1 振動能級 0 到 S0 能級 3 的可能性相當(dāng)。因此，吸收峰和發(fā)射峰相同，但發(fā)射波長更長。了解熒光團(tuán)的吸光度和發(fā)射光譜有助于確定哪種濾光片是最佳的、以及如何最好地激發(fā)一種染料而不會受到另一種染料的干擾。

6. 系統(tǒng)間交叉
不幸的是，熒光發(fā)射并不是激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)損失能量的唯一途徑。另一種能量損失途徑是在系統(tǒng)間交叉后通過禁忌躍遷到三線態(tài)。在許多熒光團(tuán)中，三線態(tài)振動能級與 S1 中的最低能級重疊。這種重疊有利于系統(tǒng)間交叉，然后內(nèi)部轉(zhuǎn)換為 T1 的最低能量。三線態(tài)分子現(xiàn)在沒有簡單的路徑回到較低能量的單線態(tài)基態(tài)，因?yàn)檫@種躍遷需要三線態(tài)外電子再次經(jīng)歷禁忌躍遷。雖然一些三線態(tài)分子在沒有光發(fā)射的情況下達(dá)到基態(tài)，但在許多情況下確實(shí)會發(fā)生稱為磷光的光發(fā)射，但它可能需要幾微秒的時(shí)間，因?yàn)樗Q于不太可能發(fā)生的禁忌躍遷。同時(shí)，如果另一個(gè)光子被吸收，三重態(tài)-三重態(tài)躍遷可以將分子移動到更高的三重態(tài)，從而進(jìn)一步延遲任何光發(fā)射。在激光掃描顯微鏡中，熒光是從一個(gè)點(diǎn)到下一個(gè)點(diǎn)快速連續(xù)測量的，磷光光子的延遲通常太長，無法將其計(jì)入正確的像素，從而削弱了熒光信號。此外，由于三重態(tài)的分子無法快速循環(huán)吸收和發(fā)射，因此該狀態(tài)會暫時(shí)將潛在的熒光分子從總池中移除。最后，也許是最成問題的問題是，三重態(tài)分子可能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致不可逆的漂白和光毒性。

7.量子產(chǎn)率和熒光強(qiáng)度
熒光團(tuán)的量子產(chǎn)率是整個(gè)熒光光譜范圍內(nèi)總光發(fā)射的量度。它是熒光發(fā)射與非輻射能量損失之比。對于非常強(qiáng)的光源，例如激光掃描顯微鏡中使用的激光器，量子產(chǎn)率可以精確測量熒光團(tuán)可以獲得的最大強(qiáng)度。對于較暗的光源，強(qiáng)度主要取決于消光系數(shù)和量子產(chǎn)率的乘積。熒光素等熒光染料的量子產(chǎn)率較高，約為 ~0.9，而 GFP 的量子產(chǎn)率約為 0.8。更高的量子產(chǎn)率不僅會增加熒光強(qiáng)度，還意味著與系統(tǒng)間交叉相關(guān)的替代競爭光化學(xué)過程（例如漂白和自由基形成）不太可能發(fā)生。除了嘗試使用染料進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)的情況外，量子產(chǎn)率越接近 1 越好。例如，伊紅是熒光素的溴化衍生物，其量子產(chǎn)率是熒光素的五分之一，但其三線態(tài)與氧相互作用產(chǎn)生的反應(yīng)中間體（單線態(tài)氧）的產(chǎn)率是熒光素的 20 倍。曙紅激發(fā)可用于將二氨基聯(lián)苯胺光轉(zhuǎn)化為電子致密產(chǎn)物，以標(biāo)記電子顯微鏡工作的熒光位點(diǎn)。

8. 激發(fā)態(tài)壽命、能量轉(zhuǎn)移和光化學(xué)

分子在產(chǎn)生光子之前保持激發(fā)狀態(tài)的時(shí)間稱為激發(fā)態(tài)壽命。該時(shí)間主要由分子在 S1 最低能級所花費(fèi)的時(shí)間決定，通常在自發(fā)衰變到基態(tài)之前幾納秒。如果附近的另一個(gè)分子可以吸收能量，則可以縮短壽命。這種分子間相互作用既縮短了熒光壽命，又降低了量子產(chǎn)率。熒光壽命成像顯微鏡 (FLIM) 探測熒光分子附近環(huán)境的變化，因此是研究熒光標(biāo)記分子與其相互作用伙伴之間分子相互作用的重要工具。如果相互作用伙伴本身就是熒光團(tuán)，則激發(fā)態(tài)分子中的能量可以激發(fā)附近的熒光團(tuán)。這種現(xiàn)象稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)，發(fā)生在非常近的熒光團(tuán)的吸收光譜與激發(fā)熒光團(tuán)的發(fā)射光譜重疊時(shí)。供體的能量被受體吸收，然后受體發(fā)射出一個(gè)波長更長的光子。這種能量轉(zhuǎn)移對距離的強(qiáng)烈依賴性使 FRET 能夠測定遠(yuǎn)低于光學(xué)顯微鏡分辨率的分子內(nèi)距離變化。
激發(fā)態(tài)分子還可以參與各種光化學(xué)反應(yīng)。例如，光解籠鎖在生物學(xué)中被廣泛用于在光誘導(dǎo)釋放阻斷基團(tuán)后釋放生物活性化合物。一些熒光蛋白的結(jié)構(gòu)和光譜特性也會隨著光而發(fā)生變化。值得注意的是，珊瑚中的熒光蛋白 Kaede 中的紅色發(fā)色團(tuán)是由這種蛋白質(zhì)的綠色形式產(chǎn)生的，該蛋白質(zhì)通過暴露于紫外線而轉(zhuǎn)化。

02
生理熒光團(tuán)  ?    

目前，有許多探針通過積累在細(xì)胞器（如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核或突觸小泡）中來檢測生理過程的某些方面。熒光團(tuán)的開發(fā)也利用了熒光團(tuán)的吸收和發(fā)射特性對變化的環(huán)境高度敏感這一事實(shí)。熒光傳感器在與鈣離子 、氫離子或其他感興趣的分子結(jié)合時(shí)會改變其吸光度和/或發(fā)射光譜。盡管許多傳感器只能通過簡單的熒光增加或減少來估計(jì)其目標(biāo)濃度的變化，但其中一些熒光團(tuán)可用于“比率”測定，從而提供定量測量濃度的方法。通過計(jì)算染料在兩個(gè)發(fā)射或吸收波長（一個(gè)波長對目標(biāo)分子敏感，另一個(gè)波長對目標(biāo)分子不敏感）下的行為比率，可以對與目標(biāo)濃度變化無關(guān)的變化進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，例如穿過細(xì)胞的距離、不均勻環(huán)境或局部染料濃度，這些變化可能會導(dǎo)致局部吸光度或發(fā)射強(qiáng)度因所研究分子局部濃度變化以外的原因而變化。正確進(jìn)行比率成像需要充分了解測量誤差的來源以及計(jì)算方法。幸運(yùn)的是，有許多關(guān)于這種強(qiáng)大的定量技術(shù)的優(yōu)秀綜述。監(jiān)測鈣和各種其他細(xì)胞內(nèi)信號的遺傳編碼熒光探針正在迅速發(fā)展，并開始為完整系統(tǒng)中的細(xì)胞內(nèi)代謝提供窗口。一些染料對電場敏感，因此，當(dāng)它們位于分隔兩個(gè)不同電位的隔間的膜中時(shí)，它們可以提供跨膜電壓的光信號。通過與電壓敏感離子通道耦合來感知膜電位的熒光蛋白提供了未來在活體動物中同時(shí)監(jiān)測許多神經(jīng)元的神經(jīng)活動的可能性。顯然，生理功能的熒光指標(biāo)的進(jìn)化是現(xiàn)代細(xì)胞和分子生物學(xué)的勝利之一。然而，使用它們的關(guān)鍵點(diǎn)需要觀察時(shí)間和空間。這種多維成像需要高效的探測器，有時(shí)還需要快速切換濾光片，并克服活細(xì)胞成像的諸多挑戰(zhàn)。


03
熒光顯微鏡  ?    

鑒于斯托克斯位移，很容易想象如何構(gòu)建熒光顯微鏡：用一種波長照射樣本，然后過濾返回光，只看到較長波長偏移的熒光。

事實(shí)上，這與喬治·加布里埃爾·斯托克斯爵士首次注意到熒光的方式類似：據(jù)稱，紫色彩色玻璃窗將陽光過濾到奎寧水燒瓶上，然后他觀察到，奎寧水通過裝滿白葡萄酒的玻璃杯發(fā)出藍(lán)光，白葡萄酒阻擋了紫光?，F(xiàn)代熒光顯微鏡的首選方法是落射照明。在這種配置中，顯微鏡物鏡不僅具有對樣本成像和放大的熟悉作用，而且還充當(dāng)照亮樣本的聚光鏡。這種方法相對于透射或透射熒光顯微鏡（其中激發(fā)光穿過聚光鏡，發(fā)射光由物鏡收集）的優(yōu)勢在于，雖然熒光團(tuán)的激發(fā)在落射和透射顯微鏡中是等效的，但在落射照明模式下，只有從樣品反射的一小部分激發(fā)光需要在返回光路中被阻擋。這種方法的主要技術(shù)障礙是激發(fā)光和熒光發(fā)射在光路中重疊，需要一種特殊的分束器，即二向色鏡，將激發(fā)光與發(fā)射光分開。二向色分束鏡設(shè)計(jì)用于 45° 的光路。在普通熒光顯微鏡中，二向色鏡反射來自光源的較短波長光并透射發(fā)射熒光的較長波長。每個(gè)二向色鏡都設(shè)計(jì)為具有從反射到透射的過渡，該過渡位于與其一起使用的熒光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射峰之間。二向色鏡很少在沒有兩個(gè)附加濾光片的情況下使用：激發(fā)濾光片，它預(yù)選激發(fā)波長，以及僅允許較長波長的光通過返回檢測器的屏障濾光片。所有這三種類型的濾光片通常都是具有非常特定波長選擇性的干涉濾光片。這些是由許多折射率交替變化的薄材料堆疊而成的工程奇跡。有了這三個(gè)元素，即激發(fā)器、分束二向色鏡和屏障，激發(fā)光與發(fā)射光的分離效果可以非常好。例如，現(xiàn)代濾光片組可能只會將10000個(gè)錯(cuò)誤激發(fā)顏色的光子中的一個(gè)傳遞到樣本，而返回光中的比例也類似。如此高的比率對于對少量或單個(gè)熒光分子進(jìn)行成像是絕對必要的。

1. 濾色塊
許多熒光顯微鏡提供了一種方便的方法，即通過由激發(fā)器、二向色鏡和屏障濾光器組成的小塊狀濾光器支架來選擇與特定熒光團(tuán)相關(guān)的激發(fā)和發(fā)射的精確波長帶。立方體裝在一個(gè)圓形轉(zhuǎn)盤或線性塊中，可以容納2到8個(gè)獨(dú)立的立方體。這些立方體可以手動或通過計(jì)算機(jī)驅(qū)動的電機(jī)移動到位。因此，要在紅色熒光團(tuán)（如 TRITC）、綠色熒光染料（如熒光素）和藍(lán)色熒光染料（如 DAPI）之間進(jìn)行成像切換，就像從一個(gè)立方體移動到另一個(gè)立方體一樣簡單和快速。應(yīng)該記住一點(diǎn)注意事項(xiàng)。由于立方體不一定完全對齊（尤其是二向色鏡的 45° 角），因此不同立方體的圖像可能會略有偏移，因此在重疊使用不同立方體拍攝的兩幅圖像時(shí)需要小心。立方體的選擇不僅基于與特定熒光團(tuán)的光譜匹配，還基于它們是寬帶還是窄帶。寬帶立方體試圖根據(jù)染料的激發(fā)和發(fā)射光譜為其提供最大的信號。當(dāng)人們正在尋找來自單一染料的信號并且不擔(dān)心串?dāng)_時(shí)，這種立方體是首選。或者，在許多情況下，同一樣本中不同熒光團(tuán)的位置至關(guān)重要。在這些情況下，使用窄帶立方體很有用。在確定適合特定應(yīng)用的立方體時(shí)，用戶必須能夠訪問熒光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射曲線以及立方體三個(gè)元素的光譜過濾特性。


2. 光源
傳統(tǒng)上，眼睛舒適觀看或快速曝光所需的強(qiáng)度來自弧光燈。汞和氙弧光燈價(jià)格昂貴，具有潛在危險(xiǎn)，需要特殊的燈箱和電源。這兩種弧光燈在幾個(gè)重要方面有所不同。根據(jù)您的要求，氙氣或汞是更好的選擇。氙氣的優(yōu)點(diǎn)是在整個(gè)紫外線、可見光和近紅外范圍內(nèi)的波長覆蓋范圍相對均勻。然而，汞是一種光譜峰值光源，具有幾條非常強(qiáng)烈的譜線。如果這些譜線與您使用的熒光團(tuán)的激發(fā)光譜相吻合，它會提供更亮的光。汞不是某些比率染料（如 fura 2）的良好光源，對于它來說，兩個(gè)相鄰激發(fā)波長之間的信號比較會受到以下事實(shí)的干擾：其中一個(gè)波長與汞峰重疊，而另一個(gè)波長不重疊?？紤]到這些例外情況，最強(qiáng)的熒光通常來自 100 瓦汞。這是最亮的光源，因?yàn)閱挝幻娣e的平均光通量最高。因?yàn)樵诳评帐秸彰髦校娀D像聚焦在物鏡的后孔上，所以明亮照明的關(guān)鍵是電弧圖像的強(qiáng)度。令人驚訝的事實(shí)是，雖然功率（瓦數(shù)）更高的電弧會產(chǎn)生更多光，但它們更大，并且需要將其圖像縮小到實(shí)際尺寸以下才能適合物鏡的后孔，而這種縮小會導(dǎo)致圖像強(qiáng)度降低。因此，小而高強(qiáng)度的電弧可以提供更強(qiáng)烈的激發(fā)光。隨著時(shí)間的推移，由于陰極和陽極的鈍化，電弧將不容易點(diǎn)燃。燈泡也將開始顯示強(qiáng)度變化和電弧位置的輕微移動，從而導(dǎo)致閃爍。因此，一旦燈泡達(dá)到其使用壽命（汞燈為 200 小時(shí)，許多氙氣燈為 400 小時(shí)），就應(yīng)更換燈泡。對準(zhǔn)也可能出現(xiàn)偏移，導(dǎo)致弧光圖像不在物鏡后孔徑的中心，需要每周左右調(diào)整對準(zhǔn)。這需要在燈箱上設(shè)置一些調(diào)整，需要一點(diǎn)練習(xí)，但忽略此步驟會導(dǎo)致照明不均勻，并且圖像通常會暗得令人無法接受。當(dāng)將清晰的弧光圖像放在物鏡后孔徑上時(shí)，照明最均勻。雖然這個(gè)清晰的圖像意味著將存在沒有光的區(qū)域，但這種缺失只會消除樣本的一些潛在照明角度。由于熒光發(fā)射通常對照明角度不敏感，因此照明角度的不均勻性是不可見的。相反，當(dāng)電弧未很好地聚焦在后孔上時(shí)，樣品上各個(gè)位置的強(qiáng)度可能會不均勻。這種偽影會導(dǎo)致圖像中的熒光更亮或更暗。近些年，這些問題已通過開發(fā)與新型超高壓 120 W 汞鹵燈泡耦合的液體光導(dǎo)得到解決。其中一些系統(tǒng)是專門為熒光顯微鏡照明開發(fā)的（例如，Exfo Photonic Solutions 的 X-Cite 120）。這些燈泡的發(fā)射光譜類似于傳統(tǒng)的汞弧燈，但由于高壓碰撞改變了電弧中激發(fā)原子的振動能量，因此具有一些額外的光譜展寬。這種展寬，尤其是在熒光素激發(fā)區(qū)，使這些燈泡優(yōu)于傳統(tǒng)的汞弧。此類系統(tǒng)雖然價(jià)格昂貴，但弧光燈更換間隔時(shí)間更長（>1,000 小時(shí) vs. 200 小時(shí)），無需將燈箱直接連接到顯微鏡，方便使用，不存在對準(zhǔn)問題，顯微鏡視野內(nèi)照明均勻。最近明亮發(fā)光二極管 (LED) 快速發(fā)展起來，更加輕便、安全，長壽命，易控制等特點(diǎn)將逐漸取代汞燈等光源，成為熒光顯微鏡的主流光源。


3. 物鏡
由于顯微鏡物鏡既是激發(fā)標(biāo)本熒光的光源，又是收集熒光的光學(xué)元件，因此其特性對熒光圖像有很大影響。重要的是要了解，由于顯微鏡物鏡的設(shè)計(jì)過去一直以改善明場彩色圖像質(zhì)量的功能為中心，因此人們在校正色差方面投入了大量精力。這些校正對于熒光顯微鏡專家來說不那么重要，他們通常更關(guān)注激發(fā)和收集效率、分辨率和對比度。理想的熒光顯微鏡物鏡具有較高的數(shù)值孔徑 (NA)。物鏡的 NA 是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，可以在物鏡的鏡筒上找到。它比放大倍數(shù)更重要，因?yàn)樗仍O(shè)置了物鏡的分辨能力，又設(shè)置了光效率。NA 值是通過將“半角”（物鏡可以收集的垂直和最大角度射線之間的角度）的正弦乘以物鏡和蓋玻片之間介質(zhì)的折射率得出的。半角越大，可以收集的光子數(shù)量就越多，可以用來激發(fā)樣本的光量就越大。因此，通過物鏡的激發(fā)光量大致與 (NA)2 成正比，同時(shí)收集的熒光發(fā)射量也與 (NA)2 成正比。因此，觀察到的強(qiáng)度與 (NA)4 成正比。此外，油浸透鏡（其中的油與蓋玻片的折射率相匹配）可防止由于蓋玻片的反射和折射而造成的光損失，從而提高激發(fā)和收集效率。圖像強(qiáng)度也與放大倍數(shù)的平方成反比，因此最強(qiáng)烈的圖像將來自相對較低的放大倍數(shù)。高 NA 還會增加物鏡的分辨能力。最小可分辨距離為 0.61 λ / NA。此外，理想的熒光物鏡將具有相對較少的透鏡元件，以減少由于反射和雜散光眩光造成的損失。理想情況下，透鏡元件和膠合劑具有非常低的固有熒光，因此在沒有熒光信號的情況下，視野看起來完全是黑色的。最后，理想的熒光物鏡將通過紫外線、可見光和近紅外中的激發(fā)波長。所有這些信息都可以從制造商處獲得（盡管需要一些挖掘）。

可以說，專門為熒光顯微鏡專家的特殊需求而設(shè)計(jì)的物鏡正變得越來越普遍，但沒有一種物鏡在所有情況下都是理想的。樣本較厚的用戶可能需要考慮使用具有球面像差校正環(huán)的鏡頭，因?yàn)楫?dāng)樣本的折射率與蓋玻片和物鏡之間的材料不同時(shí)，這些像差會導(dǎo)致模糊和對比度降低。如果經(jīng)常處理薄切片，可能需要一個(gè)“平面”鏡頭，該鏡頭可在樣本中成像平坦的視野 - 否則邊緣可能會模糊。如果主要目的是在一個(gè)樣本平面上完美對齊藍(lán)色、綠色和紅色熒光材料，則應(yīng)考慮使用復(fù)消色差鏡頭。在購買之前，最好在自己的樣本上試用昂貴的物鏡，以確保它能提供您期望的圖像。
1. 漂白
①漂白現(xiàn)象

雖然原則上熒光團(tuán)可以在基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間無限次循環(huán)，但有機(jī)熒光團(tuán)的使用條件通常會限制循環(huán)次數(shù)。對于好的熒光團(tuán)，估計(jì) 10000-40000 次循環(huán)通常被認(rèn)為是發(fā)生永久漂白之前的極限。漂白是導(dǎo)致熒光信號永久消失的所有過程的統(tǒng)稱。另一方面，淬滅是由于熒光團(tuán)與其分子環(huán)境之間的非共價(jià)相互作用而導(dǎo)致的可逆熒光損失。上面提到的 FRET 是激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)碰撞或動態(tài)淬滅的一個(gè)例子。當(dāng)基態(tài)熒光團(tuán)與另一個(gè)分子（有時(shí)是其他相同的熒光團(tuán)：自淬滅）結(jié)合時(shí)，會發(fā)生靜態(tài)淬滅。在分子水平上，漂白有幾種不同的發(fā)生方式，可以說，大多數(shù)熒光團(tuán)的光化學(xué)反應(yīng)都不太好。很明顯，長壽命的三線態(tài)為具有激發(fā)電子的分子提供了比更短的單線態(tài)更多的與其他分子相互作用的機(jī)會。因此，大多數(shù)漂白被認(rèn)為與三線態(tài)有關(guān)。漂白中的一個(gè)重要因素似乎是三線態(tài)熒光團(tuán)和分子氧之間的相互作用。三線態(tài)可以將其能量轉(zhuǎn)移到氧氣（氧氣本身是基態(tài)的三線態(tài)），將氧氣激發(fā)到單線態(tài)。單線態(tài)氧是一種活性分子，可以參與多種與有機(jī)分子的化學(xué)反應(yīng)。這些化學(xué)反應(yīng)可以共價(jià)改變熒光團(tuán)，使其失去熒光能力（即漂白）。此外，單線態(tài)氧可以與其他有機(jī)分子相互作用，對活細(xì)胞造成光毒性。

②漂白的處理

熒光信號不如人們希望的那樣明亮，原因有很多，但漂白可能是最嚴(yán)重的。減少漂白的一種方法是使用不超過對樣本成像絕對必要的光。如果顯微鏡在落射照明端口上有孔徑光闌，請使用它將光照水平滴定到低值。視場光闌也可以縮小到只照亮一小塊區(qū)域，以最大限度地減少一般漂白并提高對比度。在固定樣本中，漂白量似乎與熒光團(tuán)經(jīng)歷的激發(fā)發(fā)射循環(huán)次數(shù)直接相關(guān)，因此昏暗的光線不會自動消除漂白。因此，在不使用時(shí)，應(yīng)始終將含有熒光樣本的載玻片存放在黑暗中，因?yàn)殚L時(shí)間的環(huán)境光會使它們褪色。
重要的是要意識到，具有相似激發(fā)和發(fā)射光譜的熒光團(tuán)可能具有截然不同的漂白率。Invitrogen 的 Molecular Probes 或 Sigma-Aldrich 等公司銷售新一代熒光團(tuán)，其光穩(wěn)定性比熒光素、羅丹明和德克薩斯紅等以前眾所周知的染料更高。Alexa 染料就是這樣一個(gè)例子，其漂白速度比舊染料慢幾倍。毫不奇怪，新熒光團(tuán)還有另一個(gè)好處；它們的強(qiáng)度很高，因?yàn)樗鼈兊牧孔赢a(chǎn)率很高，因?yàn)楦咝У臒晒獍l(fā)射可以抑制分子最終處于三重態(tài)的趨勢。
不幸的是，即使使用最好的染料，有時(shí)也需要使用會導(dǎo)致漂白的強(qiáng)度，例如用相機(jī)拍攝圖像或長時(shí)間延時(shí)成像時(shí)。對于固定樣品，將樣品浸入載玻片上，使用旨在減少漂白的封固劑是一種有效的策略。許多抗褪色劑可以在實(shí)驗(yàn)室中以相當(dāng)?shù)土膬r(jià)格配制，也可以購買現(xiàn)成的。所有這些都僅適用于固定標(biāo)本，而固定標(biāo)本有多種選擇。對苯二胺對 FITC 和羅丹明非常有效，但暴露在光線下會褪色，因此載玻片必須存放在黑暗的容器中。此外，它是一種反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)，需要小心使用以盡量減少接觸。DABCO（“Slow Fade”是 Molecular Probes 的商業(yè)版本）的效果稍差一些，但具有更高的耐光性和更低的毒性。N-丙基沒食子酸酯對于羅丹明來說比前兩種更好。此外，還有幾種專有的抗褪色封固劑（Vector Labs 的 Vectashield、Molecular Probes 的 ProLong Gold）。
值得強(qiáng)調(diào)的是，并非所有染料都同樣容易受到所有抗褪色劑的影響。對一種染料效果很好的藥劑可能對另一種染料幾乎不起作用，而對另一種抗褪色劑則可能相反。所有這些抗褪色封固劑通常都含有水-甘油混合物以及旨在通過減少單線態(tài)氧的產(chǎn)生或其壽命來減少褪色的化學(xué)物質(zhì)。水甘油混合物的折射率介于水和油之間。因此，現(xiàn)在有幾家公司正在制造物鏡和蓋玻片之間的浸沒介質(zhì)，以匹配蓋玻片另一側(cè)封固劑的折射率。折射率匹配可減輕樣本圖像中的球面像差。對于活體標(biāo)本，抗褪色劑仍不完善，盡管抗壞血酸、維生素 C 和 E、β-胡蘿卜素和低氧張力可能會提供一些緩解。在所有成像應(yīng)用中，提供所有或幾乎所有發(fā)射波長的有效通道的高質(zhì)量光學(xué)濾光片也可以減少漂白。使用具有高量子效率或低噪聲的快速膠片或相機(jī)可以縮短曝光時(shí)間并減少漂白。當(dāng)然，不會漂白的熒光探針將是最好的解決方案。這個(gè)看似不可能的命題現(xiàn)在已經(jīng)隨著量子點(diǎn)的發(fā)展而實(shí)現(xiàn)。這些復(fù)雜的三層納米晶體使用鎘鹽半導(dǎo)體作為熒光團(tuán)的等效物。點(diǎn)的外殼提供了一種方便的化學(xué)基質(zhì)，可以將點(diǎn)附著到生物配體（如親和素）上。它們具有許多顯著的特性，包括巨大的吸收范圍和波長，部分基于特定的鎘鹽，部分基于它們的大小。因?yàn)樗鼈兛梢院苄。{米），所以它們可用于各種標(biāo)記技術(shù)。它們的抗漂白性也使它們成為單分子檢測的理想選擇。

04
總結(jié)  ?    

熒光用于探測生物現(xiàn)象的應(yīng)用正在迅速擴(kuò)展到細(xì)胞和分子生物學(xué)的所有領(lǐng)域。熒光和熒光團(tuán)背后的光物理和化學(xué)原理似乎與生物學(xué)相去甚遠(yuǎn)，但理解它們是良好熒光顯微鏡的核心。此外，許多新模式，如共焦、多光子、受激發(fā)射損耗 (STED)、結(jié)構(gòu)照明、全內(nèi)反射熒光 (TIRF)、FRET、FLIM、光漂白后熒光恢復(fù) (FRAP) 和熒光相關(guān)光譜 (FCS)。最后，用于監(jiān)測活細(xì)胞活動的熒光蛋白基因工程是了解生物學(xué)最有力的新窗口之一。因此，在可預(yù)見的未來，生物學(xué)和熒光將緊密交織在一起。